医学院布莱恩·科比尔卡研究组揭示G蛋白偶联受体-G蛋白复合物形成过程


清华新闻网5月15日电 5月9日,清华大学医学院、结构生物学高精尖创新中心布莱恩·科比尔卡(Brian K. Kobilka)教授研究组于《细胞》 (Cell) 杂志在线发表了题为《G蛋白偶联受体- G蛋白复合物形成过程的结构机理》(Structural Insights into the Process of GPCR-G Protein Complex Formation)的研究论文。论文报道了 beta2 肾上腺素受体(β2AR)融合Gs蛋白羧基端肽段(GsCT)的晶体结构以及GDP结合状态下Gs蛋白(GsGDP)的晶体结构,并基于结构首次提出了beta2 肾上腺素受体-Gs蛋白复合物在形成过程的初始阶段可能的分子模型。《细胞》期刊同期还以背靠背的方式发表了布莱恩·科比尔卡教授在斯坦福大学研究组的题为《G蛋白偶联受体-G蛋白复合物的组装》(Assembly of a GPCR-G protein Complex)的研究论文,报道了利用氢氘交换质谱分析和X射线辐射裂解蛋白印记质谱分析研究 beta2 肾上腺素受体与Gs蛋白复合物形成的动态过程的工作。两篇论文相互印证,共同揭示了G蛋白偶联受体与 G蛋白复合物形成的分子机理。

G蛋白偶联受体(GPCR)家族在人体中有800多个成员,在视觉,嗅觉,味觉,以及激素和神经递质的信号转导中发挥着重要的生理功能,同时也是关键的药物研发靶点。GPCR作为膜受体蛋白,对外感知胞外的配体信号,对内结合G蛋白或者Arrestin,将信号向下游传递,调节细胞功能。在激动剂的作用下,GPCR会与二磷酸鸟苷(GDP)结合状态的G蛋白,形成短暂的复合物(GPCR-GGDP),诱发GDP的释放,得到无核酸结合的GPCR-G蛋白复合物(GPCR-Gempty)。三磷酸鸟苷(GTP)随后与GPCR-Gempty状态下的G蛋白结合,引起 G蛋白解离成Gα 与 Gβγ亚基,进而激活下游的靶蛋白,传递细胞信号(图1)。 

图1 GPCR与G蛋白复合物形成过程示意图

布莱恩·科比尔卡教授在斯坦福大学的课题组在GPCR结构生物学领域做出了开创性的工作。其于2007年首次获得了beta2肾上腺素受体的非激活态高分辨率结构,并于2011年利用模拟G蛋白的纳米抗体稳定beta2肾上腺素受体的激活态构象,获得了其激活态结构。更于2011年发表了beta2肾上腺素受体与Gs蛋白在无核酸状态下(β2AR-Gsempty)的复合物的晶体结构,首次在原子水平观测到信号从配体传递到受体再到G蛋白,该研究是GPCR领域里程碑式的成果。值得注意的是,在获得β2AR-Gsempty结构的研究中,研究者们使用核苷酸酶Apyrase水解去除复合物中的GDP,从而获得更加稳定的无核苷酸结合的GPCR-G蛋白复合物(GPCR-Gempty) 。使用Apyrase水解GDP以获得稳定GPCR-G蛋白复合物的方法,也成为了获得GPCR-G蛋白复合物的通用方法。随着冷冻电镜技术的发展,目前在PDB数据库里面有超过10个不同GPCR-G蛋白复合物的结构,所有的复合物都被稳定在没有核苷酸结合的GPCR-Gempty状态。然而这些复合物结构并没有很好的解释 GPCR与G蛋白结合的特异性。多项研究表明,GPCR与GDP结合的G蛋白之间存在一个中间状态的复合物。这个中间态的复合物可能代表了GPCR与G蛋白特异性识别的初始状态。但由于该复合物是一个不稳定的中间态,其结构信息很难获得。

相比于非激活态的GPCR,激活态的GPCR结构上最显著的特点在于第六个跨膜螺旋的外移( 10埃甚至更远的距离)。布莱恩·科比尔卡教授研究组利用多种技术证明:在只有激动剂结合的情况下,beta2 肾上腺素受体无法稳定在激活构象,需要同时在胞内区域有其他蛋白(纳米抗体或者G蛋白)稳定其激活态结构。布莱恩·科比尔卡教授多年以前启动一个课题,试图将Gs蛋白羧基端的肽段融合在beta2 肾上腺素受体的羧基端,以获得其稳定在激活态的结构,但是该课题没有成功。其在清华大学的研究组改进了蛋白编辑策略,将Gs蛋白羧基端的14个氨基酸(GsCT)融合在beta2 肾上腺素受体的胞内第三个环状区域,并引入二硫键将GsCT稳定在其结合位置,最终获得了3.7埃的 beta2 肾上腺素受体激活态下的晶体结构。在该结构中观察到的 Gs蛋白羧基端与受体相互作用的方式不同于2011年解析的β2AR-Gsempty复合物(PDB:3SN6)。Gs蛋白羧基端的两个带电的氨基酸E392Gs和R389Gs与受体相互作用,而在之前的β2AR-Gsempty复合物中与受体结合的两个氨基酸Y391Gs和H387Gs却指向了相反的方向(图2)。分子动力学模拟表明这种结合方式几乎与β2AR-Gsempty 的复合物中观察到的结合方式一样稳定。

图2 beta2 肾上腺素受体与Gs蛋白C末端的14个氨基酸(GsCT)融合蛋白的晶体结构(A),在该结构中,带电荷的氨基酸E392Gs和R389Gs与β2AR相互作用,而Y391Gs和H387Gs不参与β2AR的相互作用(B)。这一相互作用模式与β2AR-Gsempty(PDB: 3SN6)结构里观察到的方式相反(C)

同时,研究组获得了2.8埃的GDP结合状态下Gs蛋白(GsGDP)的晶体结构,在该结构中,Gs蛋白羧基端的Y391Gs和H387Gs与Gs蛋白内部其它氨基酸形成了相互作用,而E392Gs和R389Gs则暴露在Gs蛋白的表面。因此推测E392Gs和R389Gs 更有可能参与GPCR受体与G蛋白之间的初始相互作用。随后研究组通过多种生物化学手段和分子动力学模拟验证了E392Gs和R389Gs 在受体与G蛋白形成复合物过程中的重要作用。最后研究组搭建了beta2 肾上腺素受体与GDP结合状态下Gs蛋白的复合物(β2AR-GsGDP)的模型,并提出了从 GsGDP,到β2AR-GsGDP,最后到β2AR-Gsempty的复合物形成的动态模型(图3)。 

图3 β2AR与Gs蛋白形成复合物的动态模型。在GsGDP状态E392Gs和R389Gs暴露在Gs蛋白表面(A)。Gs蛋白羧基端肽段经过小的构象变化(B)可以与β2AR形成中间态复合物β2AR-GsGDP(C),在该复合物状态下,Gs蛋白利用带电氨基酸E392Gs和R389Gs与β2AR相互作用。随着GDP的释放, β2AR-GsGDP 复合物经过构象变化,成为无核酸结合的β2AR-Gsempty复合物(D),在β2AR-Gsempty复合物中,Gs利用Y391Gs和H387Gs和β2AR相互作用

清华大学医学院布莱恩·科比尔卡教授与刘翔宇博士为本文的共同通讯作者。清华大学刘翔宇博士, 博士生许心宇,以及斯坦福大学Daniel Hilger博士为本文共同第一作者。清华大学医学院刘洪涛博士、孙晓鸥博士、斯坦福大学杜洋博士(即将成为香港中文大学(深圳)科比尔卡新药研究院Tenure-track助理教授)参与了本项研究。本课题得到清华-北大生命科学联合中心,北京市高精尖结构生物学中心的资助。

原文链接:

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)30440-4

供稿:医学院

编辑:李华山

审核:周襄楠

2019年05月15日 14:04:06  清华新闻网

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